RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,且具有特异、高效等优点,RNAi已被广泛用于敲减各种基因的表达,具有广阔的应用前景。
2006年,斯坦福大学的安德鲁·法厄(Andrew Z. Fire)与马萨诸塞大学的克雷格·梅洛(Craig C. Mello)由于在RNAi机制研究中的贡献而共同获得诺贝尔生理医学奖。
安德鲁·法厄 克雷格·梅洛
RNA干扰的作用机制
化学和遗传学研究表明,RNA干扰包括起始阶段(initiation steps)和效应阶段(effector steps)两个部分。
起始阶段:外源或内源的双链RNA(dsRNA)进入细胞后,被RNase III家族核酸酶(Dicer,DCR)以ATP依赖的方式切割为长约21~24个核苷酸(Nucleotide,nt)的片段,即小片段干扰RNA分子(siRNA)。Dicer酶属于RNase III家族中不常见的成员,具有高度的保守性,在包括线虫、果蝇、拟南芥和哺乳动物等大多数的生物体内都能找到它的同源物。但是在不同生物体内,Dicer的结构域有细微的区别。dsRNA被Dicer酶切割成长为21~25nt的siRNA后,这些siRNA带有5’单磷酸和3’羟基末端,互补双链的3’端有2~3nt垂悬,这些siRNA分子则引导同源单链RNA(ssRNA)即目标mRNA的降解 。
效应阶段:siRNA与某些作用因子结合形成无活性的RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。在ATP依赖的RNA解旋酶的作用下,RISC中双螺旋的siRNA解链,随后siRNA的同义链被消除,反义链与RISC中的核酸内切酶Ago-2结合,RISC重新折叠成有活性的RISC。在靶mRNA的降解过程中,首先是通过结合在RISC上的siRNA反义链指导RISC识别靶mRNA。RISC与靶mRNA结合并在核酸内切酶Ago-2的作用下在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA,将其降解,完成siRNA介导的RNAi过程。
图1. RNA干扰作用机制的模式图
siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。
RNAi技术应用的关键点
为了将RNAi的原理应用于生物技术层面上,必须有适当的方式将外源性的siRNA(small interference RNA)导入到目标生物体内,siRNA一般为19~21个核苷酸大小,在生物体内经过一系列生化路径,引发RNA干扰效果。
siRNA的来源
1. 试管内合成:以人工方式合成所需的siRNA片段,再用PCR的方式放大产量,最后导入目标细胞当中,此方法取决于细胞的转染效率,并且由于siRNA的数量无法稳定地持续存在,无法实现长期的 RNA干扰效果;
2. 生物体内合成:将所需要的siRNA片段用载体导入目标细胞中,此方法避免了单纯以人工方式在试管中合成siRNA的局限性。
设计siRNA载体
通常选择用质粒作为将siRNA导入细胞的载体,被导入的载体能在生物体内产生类似于miRNA的发夹型siRNA,为了在生物体内合成siRNA,所设计的载体DNA应该包含以下几部分:
1. 同义链(sense strand):与生物体内转录出目标mRNA时所需的基因序列相同;
2. 反义链(antisense strand):与同义链互补配对,转录此序列则可得到与目标mRNA互补的siRNA;
3. 非互补的序列:使得载体经转录后,能形成发夹结构;
4. 其他基因经限制性酶切割的限制部位(如:BamH I &Hind III)。
设计siRNA序列
除了选择恰当的siRNA载体外,所需要的siRNA序列需要注意以下几点:
1. 设计使得末端含有5-6个A(T):siRNA载体是由RNA聚合酶III转录而表达,RNA聚合酶III可转录哺乳动物体内大部分的小片段RNA,其特点是:当转录到5-6个腺嘌呤核苷酸A时会停止转录,故导入的siRNA载体经转录后,可得到末端具有5-6个尿嘧啶的siRNA;
2. 选择2-5个目标基因的不同部分序列:生物体内的目标mRNA,可能部分区域被调节蛋白附着,造成RNAi不易进行,故要选择转录出目标mRNA的不同基因片段,才能使得抑制基因表达的效率提升。
RNAi作用的特征
RNAi是由双链RNA引起的序列特异的转录后基因沉默,即外源基因的转入只对成熟 RNA的产生作用,对RNA前体没有或很少具有影响,所以含有内含子或启动子序列的外源dsRNA是无法引起RNAi效应的。将外源 dsRNA引入生物体内能特异地抑制有同源序列基因的表达,产生类似于目的位点的无义突变表型。RNAi的效应有以下几个明显特征:
1. RNAi是转录后水平的基因沉默机制;
2. RNAi具有很高的特异性,只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA;
3. RNAi抑制基因表达具有很高的效率,表型可以达到缺失突变体表型的程度,而且很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达,是以催化放大的方式进行的;
4. RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;
5. dsRNA不得短于21个碱基,并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21bp左右的siRNA,并由siRNA来介导mRNA切割,而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰,而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;
6. ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失,这显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程,可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。
RNAi应用方向
RNAi可运用于许多方面,其原理都是用基因沉默的方式抑制基因表达,达到所需的目的。例如:
1. 生物体的研究:运用RNAi的方式,研究某个基因在生物体内的功能,比如说在信号通路、胚胎发育等等方面的功能;
2. 作物改良:減少作物中会引起过敏的蛋白质成分;
3. 基因治疗:在疾病治疗方面,双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗,如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等;在抗病毒治疗方面,帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法;肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。
RNA干扰回复实验
RNA干扰回复实验,主要是为了说明脱靶效应,即off-target效应。简单来说,脱靶效应是指干扰RNA序列进入了microRNA途径,通过microRNA途径,其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。原本需要19~23nt的RNA序列完全互补才能发生干扰作用,而如果进入microRNA途径,只需要11~15nt互补就可以产生干扰效果,这使得siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默,造成脱靶。如果脱靶干扰的部分基因,正好与目的基因位于同一信号通路中,或者与目的基因的生物学功能相似,那么,如果因脱靶而干扰了其他基因,也会造成和目的基因被干扰后相类似的表型,而实际上,可能选择的这条siRNA序列并没有对目的基因造成有效干扰,或者虽然干扰了目的基因,但是并不会引起预期的表型。
基于以上原因,越来越多的杂志要求研究者们在投稿时需要有相应的对照来说明脱靶效应,即需要有相关对照或者实验来说明,研究者们所获得的实验结果,不是由于脱靶效应产生的,脱靶效应极大地限制了RNA干扰技术的发展和使用。